Pregabaliini ei ole GABAA- tai GABAB-reseptorin agonisti.
Pregabaliini on gabapentinoidi ja se toimii estämällä tiettyjä kalsiumkanavia.Erityisesti se on tiettyjen jänniteriippuvaisten kalsiumkanavien (VDCC:t) α2δ-apuyksikkökohdan ligandi ja toimii siten α2δ-alayksikköä sisältävien VDCC:iden inhibiittorina.Lääkettä sitovia α2δ-alayksikköjä on kaksi, α2δ-1 ja α2δ-2, ja pregabaliinilla on samanlainen affiniteetti (ja siten selektiivisyyden puute) näiden kahden kohdan välillä.Pregabaliini sitoutuu selektiivisesti α2δ VDCC-alayksikköön.Huolimatta siitä, että pregabaliini on GABA-analogi, se ei sitoudu GABA-reseptoreihin, ei muutu GABA:ksi tai toiseksi GABA-reseptoriagonistiksi in vivo, eikä se suoraan moduloi GABA-kuljetusta tai aineenvaihduntaa.Pregabaliinin on kuitenkin havaittu lisäävän annoksesta riippuvaa L-glutamiinihappodekarboksylaasin (GAD), GABA:n syntetisoinnista vastaavan entsyymin aivoekspressiota, ja siten sillä voi olla epäsuoria GABAergisiä vaikutuksia nostamalla GABA-tasoja aivoissa.Tällä hetkellä ei ole näyttöä siitä, että pregabaliinin vaikutuksia välittäisi jokin muu mekanismi kuin α2δ-pitoisten VDCC:iden esto.Vastaavasti α2δ-1:tä sisältävien VDCC:iden estäminen pregabaliinilla näyttää olevan vastuussa sen kouristuksia ehkäisevistä, analgeettisista ja ahdistusta lievittävistä vaikutuksista.
Endogeeniset α-aminohapot L-leusiini ja L-isoleusiini, jotka muistuttavat läheisesti pregabaliinia ja muita gabapentinoideja kemialliselta rakenteeltaan, ovat α2δ VDCC-alayksikön näennäisiä ligandeja, joilla on samanlainen affiniteetti kuin gabapentinoideilla (esim. IC50 = 71 nM L- isoleusiini), ja niitä on ihmisen aivo-selkäydinnesteessä mikromolaarisina pitoisuuksina (esim. 12,9 µM L-leusiinille, 4,8 µM L-isoleusiinille).On teoriassa, että ne voivat olla alayksikön endogeenisiä ligandeja ja että ne voivat kilpailla antagonisoida gabapentinoidien vaikutuksia.Sen mukaisesti, vaikka gabapentinoideilla, kuten pregabaliinilla ja gabapentiinilla, on nanomolaarinen affiniteetti α2δ-alayksikköön, niiden tehot in vivo ovat alhaisella mikromolaarisella alueella, ja kilpailun endogeenisten L-aminohappojen sitoutumisesta on sanottu olevan todennäköisesti vastuussa tästä erosta.

Yhdessä tutkimuksessa pregabaliinilla havaittiin olevan 6 kertaa suurempi affiniteetti kuin gabapentiinilla α2δ-alayksikköä sisältäviin VDCC:ihin.Toisessa tutkimuksessa havaittiin kuitenkin, että pregabaliinilla ja gabapentiinilla oli samanlaiset affiniteetit ihmisen rekombinantti-α2δ-1-alayksikköä kohtaan (Ki = 32 nM ja 40 nM, vastaavasti).Joka tapauksessa pregabaliini on 2–4 kertaa tehokkaampi kuin gabapentiini kipulääkkeenä, ja eläimillä se näyttää olevan 3–10 kertaa tehokkaampi kuin gabapentiini kouristuksia ehkäisevänä aineena.