Pregabaliini ei ole GABAA- tai GABAB-reseptorin agonisti.
Pregabaliini on gabapentinoidi ja se toimii estämällä tiettyjä kalsiumkanavia. Erityisesti se on tiettyjen jänniteriippuvaisten kalsiumkanavien (VDCC:t) α2δ-apuyksikkökohdan ligandi ja toimii siten α2δ-alayksikköä sisältävien VDCC:iden inhibiittorina. Lääkettä sitovia α2δ-alayksikköjä on kaksi, α2δ-1 ja α2δ-2, ja pregabaliinilla on samanlainen affiniteetti (ja siten selektiivisyyden puute) näiden kahden kohdan välillä. Pregabaliini sitoutuu selektiivisesti α2δ VDCC-alayksikköön. Huolimatta siitä, että pregabaliini on GABA-analogi, se ei sitoudu GABA-reseptoreihin, ei muutu GABA:ksi tai toiseksi GABA-reseptoriagonistiksi in vivo, eikä se suoraan moduloi GABA-kuljetusta tai aineenvaihduntaa. Pregabaliinin on kuitenkin havaittu lisäävän annoksesta riippuvaa lisäystä L-glutamiinihappodekarboksylaasin (GAD) aivoissa, joka on GABA:n syntetisoinnista vastaava entsyymi, ja näin ollen sillä voi olla epäsuoria GABAergisiä vaikutuksia nostamalla GABA-tasoja aivoissa. Tällä hetkellä ei ole näyttöä siitä, että pregabaliinin vaikutuksia välittäisi jokin muu mekanismi kuin α2δ-pitoisten VDCC:iden esto. Vastaavasti α2δ-1:tä sisältävien VDCC:iden estäminen pregabaliinilla näyttää olevan vastuussa sen kouristuksia ehkäisevistä, analgeettisista ja ahdistusta lievittävistä vaikutuksista.
Endogeeniset α-aminohapot L-leusiini ja L-isoleusiini, jotka muistuttavat läheisesti pregabaliinia ja muita gabapentinoideja kemialliselta rakenteeltaan, ovat α2δ VDCC-alayksikön näennäisiä ligandeja, joilla on samanlainen affiniteetti kuin gabapentinoideilla (esim. IC50 = 71 nM L- isoleusiini), ja niitä on ihmisen aivo-selkäydinnesteessä mikromolaarisena pitoisuudet (esim. 12,9 μM L-leusiinille, 4,8 μM L-isoleusiinille). On teoriassa, että ne voivat olla alayksikön endogeenisiä ligandeja ja että ne voivat antagonisoida kilpailevasti gabapentinoidien vaikutuksia. Sen mukaisesti, vaikka gabapentinoideilla, kuten pregabaliinilla ja gabapentiinilla, on nanomolaarinen affiniteetti α2δ-alayksikköön, niiden tehot in vivo ovat alhaisella mikromolaarisella alueella, ja kilpailun endogeenisten L-aminohappojen sitoutumisesta on sanottu olevan todennäköisesti vastuussa tästä erosta.

Yhdessä tutkimuksessa pregabaliinilla havaittiin olevan 6 kertaa suurempi affiniteetti kuin gabapentiinilla α2δ-alayksikköä sisältäviin VDCC:ihin. Toisessa tutkimuksessa havaittiin kuitenkin, että pregabaliinilla ja gabapentiinilla oli samanlainen affiniteetti ihmisen rekombinantti-α2δ-1-alayksikköön (Ki = 32 nM ja 40 nM, vastaavasti). Joka tapauksessa pregabaliini on 2–4 kertaa tehokkaampi kuin gabapentiini analgeettina, ja eläimillä se näyttää olevan 3–10 kertaa tehokkaampi kuin gabapentiini kouristuksia ehkäisevänä aineena.